とても頑張り屋の男の子、ニモ。父マーリンと母コーラルの一人息子で、オーストラリアのグレートバリアリーフに住んでいます。ある日、ダイビング中の歯医者さんにつかまってしまったニモは、歯科医院の水槽に閉じ込められます。水槽の中では、脱走のプロのギルや、愉快な仲間たちと出会います。

心配性の父親、マーリン。凶暴なバラクーダから家族を守ることが出来なかったマーリンは、ただ一匹生き残った息子のニモをとても大事に育てています。ニモが危険な目に合わないようにするため、過保護になることも。人間に捕まったニモを助け出すため、危険に満ちた大海原の旅に出ます。

おしゃべりが大好きなナンヨウハギのドリー。人間の文字を解読するという隠れた才能を持っていますが、物忘れが激しいところもあります。息子のニモを探すマーリンと友達になり、一緒に旅に出ます。

150歳の現役サーファー、クラッシュ。おおらかな性格で、息子のスクワートのことは甘やかすことなく、あたたかく見守っています。くらげに刺されて気を失ったマーリンたちをアオウミガメ仲間とともに助け、シドニー近くまで送り届けてくれます。

クラッシュの息子の幼い亀。スクワートは父親ととても仲が良く、東オーストラリア海流（EAC）でスイスイと波に乗るサーファーです。ドリーたちとかくれんぼや追いかけっこをして遊び、物語の最後ではニモのいる学校に留学してきます。

魚たちに恐れられるホオジロザメ。ブルースは、「魚は友だち、エサじゃない」をモットーに、サメの悪いイメージを変えるため、サメ仲間のアンカーとチャムと一緒に魚を食べないという誓いをたてています。しかし、血の匂いをかぐと凶暴になってしまい、手がつけられません。

ブルースのサメ仲間の一員で、シュモクザメのアンカー。サメの悪いイメージを変えるための誓いを熱心に守ろうとしています。サメよりもイルカがかわいいと皆が思っているのが許せないようです。

釣り針の鼻ピアスをしているアオザメのチャム。サメ仲間の一員で、ブルースを尊敬しており、魚を食べない誓いを守ろうとしていますが、その口からは骨になった魚が、、、。

オーストラリア・ペリカンのナイジェル。歯医者さんの診療所を観察するのが大好き。タンク・ギャングと呼ばれる、歯科医院の水槽に住む魚たちの友達です。

歯科医院の水槽に住むハリセンボンのブロート。短気な性格で、怒ったり興奮したりすると、体がパンパンにふくれてしまいます。

歯科医院の水槽に住むキイロハギのバブルス。泡（バブル）が大好きで、水槽の底にある宝の箱からでてくる泡に夢中です。

歯科医院の水槽に住むツノダシ。仲間思いで頼りになる、魚たちのリーダー的存在です。生まれ育った海に帰るため、何度も脱出を計画しては失敗しています。水槽の仲間と共にニモと兄弟の契りを結び、”シャークベイト”という名前を付けます。

歯科医院の水槽に住むスズメダイ。水槽のガラスに映った自分の姿を、双子の姉妹のフローだと信じています。

歯科医院の水槽に住むロイヤル・グランマ。潔癖症で、清潔なもの以外は絶対にさわろうとしません。

歯科医院の水槽に住むアカシマシラヒゲエビ。水槽の掃除係。フランスなまりがあり、自分を海洋学者のジャック・クストーだと思い込んでいます。

歯科医院の水槽に住むヒトデ。水槽のガラスにへばりついて見張り番をしています。やさしい性格で、世話好きです。

ニモの学校仲間のタコ、パール。いつも足をクネクネさせていて、ビックリするとスミをはきます。

ニモの学校仲間のタツノオトシゴ、シェルドン。水アレルギーの男の子で、安全なサンゴ礁から外にでていくという、危険なゲームをしようと言い出します。

ニモの学校仲間のフエヤッコダイ、タッド。わんぱくな男の子です。